澎湃新闻记者何立平
新的皇冠流行病威胁着全球公共健康。为了预防和控制新的皇冠流行病，人类迫切需要疫苗。一种新的冠状病毒灭活疫苗命名为BBIBP-CorV，由中国科研团队研制，在动物实验中显示出巨大的潜力：该疫苗高效、安全，可在小鼠、大鼠、豚鼠、兔和非人灵长类动物(食蟹猴和恒河猴)中诱导高水平的中和抗体滴度，2g/剂可提供对新冠状病毒的高效保护。同时，候选疫苗是我国研制的第二种重要灭活疫苗，增加了我国候选疫苗的选择。
上述结果来自于国际权威学术期刊《细胞》(CELL)6月6日(当地时间：《开发候选灭活疫苗BBIBP-CorV，对SARS-CoV-2能提供有效保护》)在网上发表的一篇轰动性论文(开发一种活性疫苗候选物，bbibp-corp，具有抗非典的潜在保护作用-cov-2)。
本文作者为中国科学院院士、中国疾病预防控制中心主任高福、中国医学科学院实验动物医学研究所所长、中国疾病预防控制中心病毒病研究所应急技术中心主任谭、清华大学教授楼智勇、中国食品药品检验所研究员、中国疾病预防控制中心首席生物安全专家、病毒病研究所党委书记吴等。
研究团队来自北京生物制品研究所有限公司、中国疾病预防控制中心传染病防治研究所、国家人类疾病动物模型资源中心、国家卫生保健委员会人类疾病比较医学重点实验室、中国医学科学院医学实验动物研究所、北京协和医科大学比较医学中心、北京新发和复发性传染病动物模型研究重点实验室、清华大学等。
研究人员详细介绍了实验性生产的传染性非典型肺炎CoV-2灭活候选疫苗(BBIBP-CorV)，该疫苗可在小鼠、大鼠、豚鼠、兔和非人灵长类动物(食蟹猴和恒河猴)中诱导高中和抗体滴度，从而为传染性非典型肺炎CoV-2提供保护。在恒河猴的气管内免疫中，该研究使用2g/剂量的BBIBP-CorV来提供对非典-CoV-2的高效保护，而未检测到抗体依赖性增强(ADE)感染。此外，BBIBP-CorV在疫苗生产中表现出高生产率和良好的遗传稳定性。
与传染性非典型肺炎冠状病毒和多囊卵巢综合征冠状病毒相比，传染性非典型肺炎冠状病毒2型传播速度似乎更快，因此迫切需要疫苗。到目前为止，已经报道了三种候选疫苗(包括灭活疫苗、腺病毒载体疫苗和脱氧核糖核酸疫苗)来保护恒河猴对抗具有不同效果的非典-CoV-2。灭活疫苗被广泛用于预防新的传染病。它们的发展速度很快，在预防新的冠状病毒方面有很好的发展前景。值得注意的是，新的证据表明抗体依赖性增强(ADE)可能存在于传染性非典型肺炎冠状病毒感染中，这表明在开发冠状病毒疫苗时应特别注意安全性评价。
该国第一个灭活的新皇冠疫苗来自国家药品集团中国生物。国药生物制品有限公司4月14日宣布，该公司新型冠状病毒灭活疫苗的第一阶段临床试验已在河南焦作进行。
另一方面，由中国科学院军事医学研究所生物工程研究所陈伟院士团队和中国CanSino公司联合研制的腺病毒5型(Ad5)载体疫苗也取得了重大进展。当地时间5月22日晚，顶级医学杂志《柳叶刀》(《柳叶刀》)发表了一篇题为“重组腺病毒5型载体COVID-19疫苗的安全性、耐受性和免疫原性：剂量增加、开放标记、非随机、首次人体试验”的论文。陈伟等研究人员在疫苗接种后28天内报告了中国健康成人使用的Ad5载体COVID-19疫苗的1期临床资料，并对疫苗的安全性、耐受性和免疫原性进行了初步评价。
疫苗设计和生产
研究小组从3名新入院患者的支气管肺泡灌洗样本和咽拭子中分离出3株SARS-CoV-2菌株，用于建立SARS-CoV-2灭活候选疫苗的临床前体外和抗病毒动物模型。这三种新的冠状病毒毒株是：19ncov-CDC-tan-hb02 (hb02)、19 ncov-CDC-tan-菌株03 (cq01)和19 ncov-CDC-tan-菌株04 (QD01)。这三个菌株分散在进化树的不同位置，表明它们是典型的SARS-CoV-2。
值得注意的是，所有这些菌株都是从Vero细胞中分离出来的，并已获得世界卫生组织的疫苗生产认证。这些Vero细胞通过患者的咽喉拭子而不是其他细胞系被感染，以防止病毒培养和分离过程中可能发生的突变。高效增殖和高遗传稳定性是研制灭活疫苗的关键。他们首先发现，在三种病毒株中，HB02株的88个Vero细胞具有最佳的复制效果并产生最高的病毒产量(图1a)。因此，研究人员选择了HB02株，以进一步开发灭活疫苗。将HB02株与国内外其它来源的非典CoV-2株进行全基因组序列比较，表明HB02株与其它病毒株同源，证明主要保护性抗原(刺突蛋白)具有100%同源性。这表明它具有广泛对抗各种非典型肺炎-CoV-2菌株的潜力(补充图2)。为了获得适于高产的病毒培养基，研究人员纯化了HB02菌株，并将其在Vero细胞中传代培养以产生P1病毒培养基。P1培养基在Vero细胞上适应性培养、传代和扩增。研究人员使用7代适应菌株(BJ-P-0207)作为疫苗生产的原始种子(BJ-P1)。为了评价遗传稳定性，研究人员对其进行了3次传代培养，获得了P10病毒培养基。通过深入的测序分析，我们对HB02株和P10株进行了全基因组测序，结果表明它们的序列同源性为99.95%。此外，在P10病毒的整个序列中没有发现氨基酸变异，包括弗林切割位点附近。这些结果表明HB02菌株具有较高的遗传稳定性，有利于进一步开发。
为了高效生产，研究人员基于一种新的篮式反应堆载体建立了BBIBP-CorV的原料生产策略(图1b)。对Vero细胞中P7培养基的生长动力学分析表明，培养基病毒能够有效复制，在感染后48-72小时(hpi)达到超过7.0 log10 CCID50的最高滴度，感染的多重严重性(MOI)为0.01-0.3(图1c)。为了灭活病毒生产，研究人员将丙酸内酯与收获的病毒溶液在2-8下以1:40的比例混合。三批病毒灭活消除了病毒的传染性，并验证了灭活过程的良好稳定性和可重复性(图1d)。蛋白质印迹分析显示疫苗文库包含病毒结构蛋白(保护性抗原)(图1e)。负染色电子显微镜图像显示直径约为100纳米的椭圆形病毒颗粒(图1f)。
BBIBP-CorV的免疫原性
为了评估BBIBP-CorV的免疫原性，研究人员给BALB/c小鼠注射了不同的免疫方案和不同剂量(2，4，8g/剂量)的疫苗。
单剂量免疫组在第0天(D0)腹腔注射三个剂量，即高(8 g/剂量)、中(4g/剂量)和低(2g/剂量)BBIBP-CorV。注射后第7、14、21和28天观察中和抗体(NAb)水平。结果表明，免疫后7天，高、中、低剂量组血清转换率达到100%，免疫效果与时间有关(图2，补充表1)。中低剂量组中和抗体水平在第7、14和21天出现显著变化，但在第21和28天之间没有显著差异。在高剂量组中，仅在第7天和第14天观察到显著变化(图2a)。
两剂免疫组采用不同的免疫方案(分别在第0/7、0/14、0/21天免疫)。第二次免疫后7天，高、中、低剂量组的血清阳性率达到100%(图2 b，补充表1)。高剂量和中剂量双剂量免疫程序的免疫原性显著高于单剂量免疫程序。第0天/第21天方案第二次免疫后7天中和抗体水平最高。
研究人员还测试了三种剂量免疫程序的免疫原性。他们在第0、7和14天分别用高(8微克/剂量)、中(4微克/剂量)或低(2微克/剂量)三种剂量的疫苗对小鼠进行腹腔接种(图2c)。在第7、14、21和28天测定各组的中和抗体水平。第一次免疫后第7天，所有三组的血清转化率达到100%(图2c，补充表1)。
结果表明，第28天三剂(0天/7天/14天)免疫程序的中和抗体水平高于单剂免疫程序的中和抗体水平(图2a和2c)。此外，他们分析了用单剂量、双剂量(0天/21天)和三剂量(0天/7天/14天)高、中、低剂量疫苗免疫的小鼠的中和抗体水平，并在第一次免疫后28天检测中和抗体水平以保持相同的起点和终点。结果显示三剂量(0天/7天/14天)免疫程序的免疫原性高于单剂量和双剂量免疫程序(图2d)。
接下来，他们测量了BBIBP-CorV在不同动物模型中的免疫原性，如兔、豚鼠、大鼠和小鼠。使用单剂量(D0)免疫程序，用高剂量(8g/剂量)、中剂量(4g/剂量)和低剂量(2g/剂量)疫苗免疫动物。免疫后21天测定中和抗体水平。结果显示，BBIBP-CorV具有良好的免疫原性，并且在免疫后21天的所有动物模型中，血清转化率达到100%(图2 e，补充表1)。在三剂量(0/7/14)免疫组中，食蟹猴、兔、豚鼠、大鼠和小鼠接种高(8g/剂量)中(4g/剂量)或低(2g/剂量)剂量的疫苗。免疫后21天，所有动物模型的血清转化率均达到100%。第一次免疫后21天的中和抗体水平表明，在兔和豚鼠模型中免疫程序的三个剂量(0天/7天/14天)高于免疫程序的单个剂量(0天)(图2 e 2 f，补充表1)。
非人灵长类动物模型中的保护作用
研究小组评估了BBIBP-CorV对恒河猴的免疫原性和保护作用。
所有恒河猴在第0天(D0)和第14天(D14)免疫两次。安慰剂组肌肉注射生理盐水，两个实验组肌肉注射低剂量(2g/剂量)或高剂量(8g/剂量)BBIBP-CorV(图3a)。在病毒攻击之前，低剂量组和高剂量组的NAb GMT分别达到215和256(图3b)。在D24(第二次免疫后第10天)，在麻醉下通过气管给所有恒河猴注射106 TCID50的非典-CoV-2。从病毒感染后0至7天，接种组和安慰剂组的体温在一定范围内波动(图3c，补充图4a)。
此外，恒河猴的血清生化参数在攻击后保持不变(补充图3)。这一结果表明，接种BBIBP-CorV对血清生化参数没有任何副作用。
接下来，研究小组使用逆转录聚合酶链反应来测量恒河猴喉咙和肛门拭子的病毒载量。结果显示，安慰剂组中的所有恒河猴在攻击后的整个评估期内显示并保持高病毒载量(图3d和3e，补充有图4b和4c)。
低剂量组恒河猴咽拭子的病毒载量在5dpi达到峰值(5.33 log10拷贝/ml)，在7 dpi降至1.12 log10拷贝/ml，显著低于安慰剂组。值得注意的是，在低剂量组的4只恒河猴中，有3只不能检测到7 dpi的病毒载量。高剂量组4只恒河猴咽拭子病毒载量为阴性。此外，在高剂量组的4只恒河猴的2个肛门拭子中没有检测到病毒载量。
在7 dpi时，研究小组对所有动物实施安乐死，以确定肺组织中的病毒载量并进行病理检查(图3f，3g)。在低剂量组和高剂量组中，在所有恒河猴的任何肺叶中都没有检测到病毒载量，这与安慰剂组有显著差异(图3f)。在安慰剂组中，在左肺、右肺和右副肺中检测到高病毒载量，并且组织病理学分析显示严重的间质性肺炎。
然而，值得注意的是，安慰剂组的7个肺叶中只有3个被检测出感染。文章指出，这可能是因为病毒在肺叶的感染是动态的。
总的来说，所有恒河猴的肺
在7dpi时，接受安慰剂的恒河猴产生低水平的NAb，滴度为1:16，而高剂量组的最高NAb水平为1:248(平均为1:860)，低剂量组的最高NAb水平为1:24(平均为1:512)(图3b)。该研究指出，这些结果表明，低剂量和高剂量的牛传染性法氏囊病病毒对恒河猴的严重急性呼吸综合征-CoV-2具有高保护作用，并且没有观察到抗体依赖性增强感染。
安全性
研究小组首先对大鼠进行了一次肌肉注射实验(Sprague-Dawley)，以评估BBIBP-CorV的急性毒性。本研究将20只大鼠分为2组(n=10，5/性别)，肌肉注射3倍剂量的BBIBP-CorV (8g/剂量，24g/大鼠)，对照组为生理盐水。接种后继续观察14天，第15天实施安乐死，并进行系统解剖和观察。
四组大鼠在接种后连续14天内未死亡或即将死亡，未发现明显临床症状。此外，实验组和对照组之间的体重和进食状态没有显著差异(图4a，补充图4d)。安乐死后，这些大鼠没有组织病理学变化。
值得注意的是，大鼠单次肌肉注射的最大耐受剂量为24g/大鼠，是人体的900倍。研究小组认为，这表明BBIBP-CorV对人体具有潜在的良好安全性。
研究小组随后评估了豚鼠肌肉注射和静脉注射BBIBP-CorV引起的全身过敏反应。通过临床观察和测量豚鼠体重，结果显示在致敏期间没有异常反应(图4b)。阴性对照组(生理盐水)和实验组D19和D26均未发现过敏反应症状。阳性对照组(人血清白蛋白)对过敏反应呈高度阳性(1/6动物为阳性，3/6动物为强阳性，2/6动物为强阳性)。与之形成鲜明对比的是，低剂量和高剂量试验组D19和D26没有过敏反应，且过敏反应为阴性。
研究小组进一步评估了BBIBP-CorV对恒河猴的长期毒性。将40只恒河猴(20只/性别)分为4组(5只/性别/组)，肌肉注射生理盐水(第1组)或2g、4g、8g BBIBP-CorV(第2-4组)。每组中的三个在D25进行解剖，另两个在D36进行系统解剖和组织病理学检查。
在试验期间，组2-4中没有发生死亡或即将死亡，并且在淋巴细胞亚群分布(cd3、cd3cd4、cd3cd8、CD20、cd3cd4/cd3cd8)、细胞因子(肿瘤坏死因子-干扰素-、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-5和白细胞介素-6)、c-反应蛋白或体重观察中没有显著异常的临床生理和病理指标(图4c-4e，补充图4e)。
在D25和D36，每个剂量组中安乐死恒河猴的系统解剖学没有异常。第2-4组在D25出现肉芽肿性炎症，并在恢复期(D36)结束时保持，但与D25相比略有改善。恒河猴仅表现出局部刺激，表现出轻微至严重的肉芽肿性炎症，但注射后两周没有这种反应。8微克/剂量实验组未显示出观察到的不良反应水平(NOAEL)。
图1
图2
图3
图4
补充图2
补充图3
补充图4
补充表1
